傳統(tǒng)基因擾動篩選的局限性

 

在生命科學研究中，基因擾動篩選（perturbation screening）是探索基因功能和表型聯(lián)系的關鍵工具(http://www.weberwork.com/sell/l_5/)。通過隨機擾動細胞中的基因組并篩選出與特定生物學現(xiàn)象相關的基因，研究人員能夠解碼復雜的遺傳網絡。然而，傳統(tǒng)的基因篩選方法盡管推動了基因組研究的發(fā)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)：

 

1. **富集策略依賴**：傳統(tǒng)方法大多依賴熒光標記或細胞分選技術（如FACS）對特定表型的細胞進行篩選，隨后通過下一代測序（NGS）識別這些細胞中的基因擾動因子（如CRISPR單鏈向導RNA, sgRNA）。這種方法的效率高度依賴于細胞的轉錄活性和胞質體積。

   

2. **低轉錄活性細胞類型**：在低轉錄活性的細胞類型（如原代細胞）中，信號可能不足，難以進行精確分析。

 

3. **高細胞密度環(huán)境下的挑戰(zhàn)**：傳統(tǒng)方法通常需要將細胞分離到單獨的孔或空間中進行測定，這種操作不僅繁瑣，還容易引入實驗偏差。在高細胞密度環(huán)境中，準確定位基因擾動的來源也極具挑戰(zhàn)性。

 

  NIS-Seq技術的突破與優(yōu)勢

 

為了克服上述瓶頸，研究人員開發(fā)了一種創(chuàng)新技術——核內原位測序（Nuclear In-SIT(http://www.weberwork.com/sell/l_25/)u Sequencing, NIS-Seq），其顯著特點在于通過在細胞核內生成亮度極高的測序信號，實現(xiàn)了細胞類型不可知的高密度光學篩選。

 

  核心原理

 

NIS-Seq的核心原理圍繞在細胞核內生成明亮且穩(wěn)定的信號。傳統(tǒng)的原位測序依賴于細胞胞質中的信使RNA（mRNA），而NIS-Seq則將信號生成的過程轉移到了細胞核內，關鍵在于引入了T7反向轉錄系統(tǒng)：

 

- **T7反向轉錄系統(tǒng)**：研究人員在單鏈向導RNA（sgRNA）表達盒中添加了反向的T7啟動子，從而使大量sgRNA的RNA拷貝能夠直接從基因組DNA轉錄生成。這些RNA拷貝通過逆轉錄形成cDNA，并進一步通過鎖環(huán)延伸（padlock elongation）、連接（ligation）和滾環(huán)擴增（rolling circle amplification, RCA）生成顯著增強的信號。

 

- **多輪熒光測序**：NIS-Seq采用三色激光合成測序，每輪測序生成的信號能夠明確地標記單細胞核內的基因擾動條形碼。這種方法不僅在單細胞水平上提供了極高的分辨率，還避免了傳統(tǒng)方法在高細胞密度環(huán)境中信號分配模糊的問題。例如，在實驗中，研究人員對THP1來源的巨噬細胞進行了14輪測序，生成了精準且一致的核內熒光信號，為基因擾動的高效識別奠定了基礎。

 

 技術驗證與應用

 

研究團隊在包括HeLa細胞、THP1來源的巨噬細胞和初級人巨噬細胞在內的八種細胞類型中對NIS-Seq進行了驗證，結果顯示其在高密度細胞篩選和復雜庫映射方面表現(xiàn)出極高的準確性和適用性。此外，該技術不僅被應用于解碼炎癥相關通路的關鍵基因，還成功完成了在原代人巨噬細胞中的小規(guī)模篩選，甚至實現(xiàn)了在人皮膚組織中的條形碼識別。

 

  NIS-Seq的應用前景

 

NIS-Seq技術展示了在基礎研究和臨床轉化中的廣闊前景，特別是在以下領域：

 

- **細胞遷移**：研究細胞如何響應外部信號進行遷移，揭示癌癥轉移機制。

- **蛋白質復合物形成**：解析蛋白質相互作用網絡，理解疾病發(fā)生機制。

- **動態(tài)信號轉導**：探索細胞內外信號傳遞路徑，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。

 

通過這些技術創(chuàng)新，NIS-Seq顯著提高了基因組篩選的效率和廣泛適配性。它突破了傳統(tǒng)技術對細胞類型和轉錄活性的限制，使得在低活性細胞和原代細胞中也能穩(wěn)定生成清晰信號，為探索基因功能開辟了全新路徑。這項技術有望成為未來基因擾動篩選的主流工具，引領基因組學研究進入新時代。