近日，美國斯坦福大學(xué)的Steven M. Banik團(tuán)隊(duì)在《自然》（*Nature*）上發(fā)表了一篇題為《通過蛋白質(zhì)運(yùn)輸(http://www.weberwork.com/sell/l_19/)耦合實(shí)現(xiàn)靶向蛋白重定位》（*Targeted protein relocalization via protein transport coupling*）的研究論文。該研究開發(fā)了一種創(chuàng)新的化學(xué)(http://www.weberwork.com/sell/l_9/)生物學(xué)工具(http://www.weberwork.com/sell/l_5/)——靶向重定位激活分子（TRAM），通過結(jié)合穿梭蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)來控制目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位。這一技術(shù)不僅為理解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)提供了新視角，還為治療蛋白質(zhì)定位異常相關(guān)疾病提供了新的策略。
#### 研究背景
蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位對(duì)其功能至關(guān)重要。核定位序列（NLS）和核輸出序列（NES）可被karyopherin蛋白家族識(shí)別，以調(diào)節(jié)貨物在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的雙向運(yùn)輸。然而，要通過蛋白質(zhì)運(yùn)輸耦合的方式來克服蛋白質(zhì)的固有定位，需要滿足兩個(gè)條件：（1）在穿梭蛋白上有一個(gè)足夠強(qiáng)的相反定位序列；（2）穿梭蛋白的必要化學(xué)計(jì)量比。
#### 技術(shù)原理與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1. **模型蛋白的選擇**：
- 研究人員選擇了煙酰胺核苷酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶1（NMNAT1）作為模型蛋白進(jìn)行重新定位研究。NMNAT1只有一個(gè)預(yù)測(cè)的NLS且沒有已知的直接DNA結(jié)合域，因此可能容易受到小分子介導(dǎo)的重新定位的影響。
2. **TRAM的設(shè)計(jì)與合成**：
- 研究人員合成了雙功能分子TRAM 1，其能夠與大腸桿菌二氫葉酸還原酶結(jié)構(gòu)域（EcDHFR）和FKBP12F36V結(jié)構(gòu)域結(jié)合。這些結(jié)構(gòu)域因其與大多數(shù)哺乳動(dòng)物蛋白的緊密結(jié)合親和力和正交性而被廣泛使用。
3. **穿梭蛋白的構(gòu)建與驗(yàn)證**：
- 研究人員生成了mCherry融合EcDHFR和來自HIV-1 REV蛋白的NES作為穿梭蛋白，并在HeLa細(xì)胞中穩(wěn)定地整合了mCherry-EcDHFR-NES和FKBP12F36V-GFP-NMNAT1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在TRAM 1的介導(dǎo)下，NMNAT1表現(xiàn)出劑量依賴性地向細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移。
#### 定量分析方法
為了準(zhǔn)確評(píng)估蛋白質(zhì)的重新定位，研究人員開發(fā)了一個(gè)定制的計(jì)算成像分析流程，能夠在單細(xì)胞級(jí)別獨(dú)立地在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中對(duì)兩種不同蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。這種方法適用于不同的細(xì)胞類型和密度，能夠檢測(cè)劑量、穿梭蛋白和化學(xué)計(jì)量依賴的再定位。
#### 應(yīng)用與驗(yàn)證
1. **多種內(nèi)源蛋白的重新定位**：
- 研究人員使用核激素受體（如雌激素受體ERα和糖皮質(zhì)激素受體GR）作為穿梭蛋白，檢測(cè)了三種已知在疾病中表現(xiàn)出異常定位的突變蛋白——SMARCB1Q318X、TDP43ΔNLS和FUSR495X——的重新定位能力。結(jié)果顯示，不同的突變蛋白對(duì)ERα介導(dǎo)的重新定位的敏感性不同，TDP43ΔNLS和FUSR495X比SMARCB1Q318X更容易被ERα重新定位。
2. **內(nèi)源性蛋白的重新定位**：
- 研究人員采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，將結(jié)合域和熒光蛋白標(biāo)簽插入到內(nèi)源性蛋白PRMT9、SOS1和FKBP12上，使用metaP2和PARP1作為內(nèi)源性細(xì)胞質(zhì)和核的穿梭蛋白，并合成了能夠與它們結(jié)合的TRAM 11-13。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，即使在內(nèi)源性蛋白表達(dá)水平下，通過TRAM介導(dǎo)的內(nèi)源性蛋白重新定位也是可行的。
3. **體外模型的應(yīng)用**：
- 研究人員使用TRAM 1處理轉(zhuǎn)導(dǎo)了攜帶mNMNAT1和EcDHFR標(biāo)簽的腺相關(guān)病毒（AAV）的大鼠胚胎的背根神經(jīng)節(jié)（DRG）神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)TRAM 1可以促進(jìn)NMNAT1從細(xì)胞核向軸突的重新定位，NMNAT1在軸突中的表達(dá)得到了維持，即使在軸突損傷后也能觀察到軸突的健康狀況和軸突末端的保護(hù)。
#### 結(jié)論與展望
本研究開發(fā)了一種定量的單細(xì)胞分析方法來檢查通過TRAM介導(dǎo)的目標(biāo)蛋白與穿梭蛋白的耦合潛力，展示了兩種蛋白質(zhì)伙伴的相對(duì)表達(dá)水平是推動(dòng)目標(biāo)蛋白重新定位能力的主要參數(shù)。通過與內(nèi)源性穿梭蛋白的耦合，可以改變內(nèi)源性目標(biāo)蛋白的定位。這一技術(shù)為治療蛋白質(zhì)定位異常相關(guān)疾病提供了新的可能性。通過精確控制蛋白質(zhì)的定位，不僅可以糾正因蛋白質(zhì)錯(cuò)位導(dǎo)致的疾病表型，還可以通過蛋白質(zhì)重新定位賦予有益的功能，更細(xì)致地調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，從而擴(kuò)大治療選擇的范圍，為開發(fā)新的治療方法提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)策略。
